آذران پلاسمید
بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک
درباره وبلاگ


اخبار علمی،ارائه ی مقالات و مطالب در مورد بیوتکنولوژی

نویسندگان
جمعه دوم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM

رشد سلول های نرمال، تکامل جنینی و پاسخ به استرس ها به کنترل بیان ژن موقت و مناسب نیاز دارد. مطالعه در مورد کنترل فرآیند رونویسی (سنتز RNA) به نحوه عملکرد آنزیم RNA پلیمراز در شناسایی و نسخه برداری یک ژن وابسته است. کارهای جدید روی نحوه کنترل سنتز RNA به شناسایی یک مدل ثانویه در سیستم مدل مخمر منجر شده است. نتیجه این آزمایش ها نشان داده است که برخی از ژن ها تحت فرآیند کاهندگی به صورت خاموش نگه داشته می شوند و تنها در شرایط استرس فعال شده یا بیان می شوند. در شرایط کاهندگی RNA پلیمراز رونویسی از ژن را آغاز می کند اما، این فرآیند خیلی زود پایان می یابد و این عمل با استفاده از ایجاد کمپلکس پایانی متصل به آنزیم انجام می شود. این عمل کاهندگی در باکتری ها یک امر عادی است و کنترل بسیاری از ژن های متابولیسمی با این روش انجام می شود مانند ژن های متابولیسم آمینواسید تریپتوفان. اما این نحوه کنترل در یوکاریوت ها یک امر رایج نیست و تا کنون معرفی نشده بود.

در پاسخ به یک سیستم القا استرس، کاهندگی باید غلبه کند آنچنان که یک ژن هدف بیان شود. آقای لوین از دانشگاه بوستون آمریکا این طور  می گوید: در روشی که در این کار استفاده شده است یک فاکتور فعال کننده رونویسی به نام Mpk1، یک عملکرد دوگانه انجام می دهد. وظیفه اول این فاکتور کمک به RNA پلیمراز است تا بتواند پروموتر را شناسایی کند. در دومین مرحله این فاکتور قادر است تا به آنزیم در حال رونویسی متصل شود تا از متصل شدن کمپلکس پایانی جلوگیری کند.

جهش ها در یک پروتئین انسانی به نام Senataxin که با یک ترکیب کمپلکس پایانی مخمر در مشابه است، عامل ایجاد بیماری هایی مانند آتاکسیا و ALS، دو بیماری تخریب کننده عصب-عضله هستند. در آخرین تحقیقات نشان داده شد که این روش تنظیم کاهندگی در انسان از لحاظ تکاملی حفاظت شده است. زمانی که پروتئین های کاهنده مخمر با انواع انسانی آن جایگزین شوند آن ها قادر هستند تا برهمکنش های مشابهی داده و عمل کاهندگی را در کنترل بیان ژن مخمر انجام دهند.

لوین معتقد است که کاهندگی حقیقتاً یک رویداد بسیار گسترده است. تقریباً 10% از ژن های مخمر تحت کنترل کاهندگی هستند که پیشنهاد کننده این مطلب است که در انسان نیز چنین ژن هایی تحت کنترل کاهندگی باشند.


نوع مطلب : بیولوژی سلولی،
برچسب ها :

جمعه دوم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM

نگاه کلی

مقدار اطلاعات موجود در یاخته‌های یوکاریوتی خیلی بیشتر از پروکاریوتهاست. فرصت عمل در جایگاه‌های متفاوت از هسته سلول تا سیتوپلاسم برای تنظیم کننده‌ها نیز بیش از پروکاریوتهاست. اطلاعات ژنتیکی در یوکاریوتها در ساختارهای کروموزومی که اغلب پیچیدگی زیادی دارند نهفته است و رونویسی و بروز ژنها در آنها کاهش تراکم قبلی این ساختار را ایجاب می‌کند. بنابراین در یوکاریوتها سیستمهای تنظیم کننده بیشتر ، دقیقتر و بویژه پیاپی هستند. این سیستمها در جایگاهها و در حد ساختارهای متفاوت سلولی عمل می‌کنند و می‌توانند وابسته به یکدیگر باشند. به عنوان مثال تنظیم بیان ژن مالتوز در بسیاری از یوکاریوتها نیز دیده می‌شود.

پروموترهای یوکاریوت اغلب شامل چندین جایگاه اتصال برای فعال کننده‌ها هستند و در بسیاری از موارد ، فعال سازی به توالیهایی نیاز دارد که از نقطه شروع نسخه برداری فاصله زیادی دارند. فقط تعداد کمی از ژنهای یوکاریوتی بوسیله رپرسور کنترل می‌شوند و نسخه برداری اکثر ژنهای یوکاریوتی ، در عدم حضور یک فعال کننده انجام پذیر نیست. در پروکاریوتها ، معمولا پروتئینهای تنظیمی و جایگاههای اتصال آنها هر دو شناخته شده است. در حالی که در یوکاریوتها در بسیاری از موارد فقط توالیهای تنظیم کننده DNA مورد شناسایی قرار گرفته است. تنها در موارد معدودی ، پروتئینهای تنظیمی یوکاریوتی و مکانیسم تنظیم نسخه برداری ، مورد بررسی قرار گرفته است.

توالیهای شناسایی شونده بوسیله فعال کننده‌ها

تاکنون دو نوع معمول از توالیهای DNA یوکاریوتی که بوسیله فعال کننده‌ها باند می‌شود، شناخته شده است. یک نوع توالی فعال (Upstream Activating Sequenc) یا UAS می‌باشد که در ناحیه Upstream بسیاری از ژنهایی که فعال کننده آنزیمهای متابولیک در یوکاریوتهای تک سلولی ، مانند مخمر یافت شده است. این توالیها بوسیله فعال کننده‌هایی که سرعت شروع نسخه برداری از پروموتوهای مربوطه را به شدت افزایش می‌دهند، باند می‌شوند.

نوع دیگری از توالیهای فعال ، Enhancer می‌باشد که در یوکاریوتهای چند سلولی یافت می‌شود. برخلاف UAS ، Enhancerها می‌توانند در '5 یا '3 یک ژن قرار گیرند و حتی در صورت فاصله زیاد از جایگاه شروع نسخه برداری قادرند نسخه برداری را تحت تاثیر قرار دهند.

تنظیم متابولیسم گالاکتوز در مخمرها

یکی از ژنهای یوکاریوتیک که توالی UAS و پروتئینهای باند شونده به آن ، هر دو مورد شناسایی قرار گرفته است، ژنی است که توسط پروتئین GAL4 در ساکارومایسین سروزیه کنترل می‌شود. پروتئین GAL4 مونومری است با وزن مولکولی 99000 که نسخه برداری حداقل 5 ژن را کنترل می‌نماید. از آن جمله می‌توان ژنهای GAL10 و گالاکتوز پرمه‌آز را کد می‌نمایند.

در ژنوم مخمر ، این ژنها در دو طرف UAS قرار دارند و در دو جهت مخالف نسخه برداری می‌شوند. پروموترهای این دو ژن در یک ناحیه 680 جفت بازی که دو ژن را از یکدیگر جدا می نمایند، قرار گرفته‌اند. همچنین در ناحیه بین دو پروموتر، یک UAS جای گرفته است. با اتصال پروتئین GAL4 به UAS ، UAS نسخه برداری هر دو ژن GAL1 و GAL10 را 1000 برابر افزایش می‌دهد.

قسمتهای تشکیل دهنده UAS

UAS گالاکتوز از چهار جایگاه جداگانه مخصوص اتصال GAL4 تشکیل یافته است که به ترتیب از شماره I تا IV شماره گذاری شده است. هر یک از این جایگاه‌های اتصال ، از یک توالی 17 جفت بازی مشابه تشکیل یافته است و دارای تقارن دو طرفی است. میل ترکیبی GAL4 برای پیوند با هر یک از جایگاههای اتصال یکسان نیست و اتصال بین حداقل دو جایگاه (IV,III) به صورت همکاری انجام می‌گیرد.

هر چند آزمایشات نشان می‌دهند که سرعت نسخه برداری ژنهای GAL1 و GAL10 ، با تعداد مولکولهای GAL4 باند شده به UAS ارتباط مستقیم دارد، فعالیت نسخه برداری به اشغال هر چهار جایگاه اتصال بوسیله GAL4 نیازی ندارد. بنابراین اثر GAL4 یک اثر اضافی است به این صورت که هر مولکول GAL4 بطور مستقل در تحریک نسخه برداری شرکت دارد.

قسمتهای تشکیل دهنده GAL4

GAL4 از دو domain تشکیل شده است، یکی مسئول باند شدن به DNA و دیگری مسئول تحریک نسخه برداری ژنهای ناحیه down stream می‌باشد. همانند اپرونهای کد کننده آنزیمهای متابولیک در پروکاریوتها ، ژنهای GAL10 , GAL4 تنها در حضور سوبسترا که در این مورد گالاکتوز می‌باشد، نسخه برداری می‌شوند.

در عدم حضور گالاکتوز ، GAL4 از طریق domain مسئول باند به DNA به UAS گالاکتوز متصل می‌شود ولی domain مسئول تحریک نسخه برداری آن ، بوسیله یک پروتئین تنظیم کننده منفی به نام GAL80 باند می‌شود. اتصال Gal80 به GAL4 از فعال سازی نسخه برداری GAL10 , GAL1 توسط GAL4 جلوگیری به عمل می‌آورد. با این حال در حضور گالاکتوز ، گالاکتوز به GAL80 باند سبب جدا شدن آن از GAL4 می‌شوند. در این حالت GAL4 قادر است نسخه برداری GAL10 , GAL1 را فعال نماید.

ممانعت از نسخه برداری بوسیله گلوکز

هر چند، هر دو ژن GAL10 , GAL1 در حضور گلوکز نیز به صورت منفی تنظیم می‌شوند، کنترل این ژنها پیچیده تر از اینهاست این ممانعت از نسخه برداری بوسیله گلوکز ، مشابه جلوگیری کاتابولیتی در پروکاریوتهاست و در صورت حضور هر دو نوع قند (گلوکز و گالاکتوز) GAL10 , GAL1 در سرعتهای پایین ، نسخه برداری می‌شوند. گلوکز ، نسخه برداری GAL10 , GAL1 را از طریق جلوگیری از باند شدن GAL4 به UAS گالاکتوز بلوکه می‌کند.

اینکه آیا گلوکز عملا به GAL4 باند می‌شود یا GAL10 , GAL1 بوسیله یک متابولیسمی از گلوکز تحریک می‌شوند، هنوز نامشخص است. بطور کلی domainهای فعالیت پروتئینهای یوکاریوتیک ، مانند GAL4 خیلی کم مورد شناسایی قرار گرفته ولی آنها را در سه طبقه تقسیم می‌نمایند.

  1. تعدادی از domoianهای فعالیت ، شامل نواحی طویلی هستند که یک آلفا هلیکس آمفی پاتیک با بار منفی را تشکیل می‌دهند. یک مثال از این نوع پروتئینها GAL4 می‌باشد. برای فعال سازی نسخه برداری ، domain فعالیت GAL4 لازم و ضروری است.

  2. تعدادی از domainهای فعالیت ، پروتئینهای غنی از گلوتامین هستند. پروتئین SP1 دارای domain از این نوع است قدرت فعال کردن نسخه برداری SP1 با برداشتن دو domain غنی از گلوتامین آن ، به شدت کاهش می‌یابد.

  3. تعدادی از domainهای فعالیت ، پروتئینهایی غنی از پرولین هستند. پروتئین CTF شامل domainای از این نوع است چگونگی تحریک نسخه برداری توسط domainهای فعالیت ، هنوز ناشناخته است ولی ممکن است، از طریق درگیر کردن پروتئینهای دیگر نزدیک RNA پلی مراز П ، اثر خود را اعمال نمایند. به عنوان مثال آزمایشات انجام شده در مخمرها نشان می‌دهند که GAL4 مستقیما با RNA پلی مراز П وارد واکنش نمی‌شود بلکه اثر خود را از طریق پروتئین دیگری اعمال می کند.

کنترل بیان ژن توسط توالیهای افزایش دهنده یا (Enhancers)

Enhancer نوع دوم از توالیهای فعال می‌باشد که در ارتباط با بسیاری از ژنهای کلاس П یافت شده‌اند. این توالیهای DNA بوسیله سه خصوصیت مشخص می‌گردند:

  1. Enhancerها اغلب در هر جهتی فعال هستند.

  2. Enhancer قادرند نسخه برداری را حتی در صورتی که از نقطه شروع آن هزاران جفت باز فاصله داشته باشند، تحت تاثیر قرار دهند. آنها بعضی اوقات در یک انترون یا در انتهای '3 یک ژن قرار دارند.

  3. Enhancer ها، نسخه برداری هر ژنی در مجاورشان را تحت تاثیر قرار می‌دهند.

بررسیها نشان می‌دهند که Enhancerها ، بسیاری از ژنهای ویروسی را نیز فعال می‌نمایند. این نوع Enhancerها که تحت عنوان ، Enhancerهای ویروسی شناخته می‌شوند، برای انجام عمل خود به فعال کننده‌های خاصی نیاز دارند. این ، خودش توجیهی است بر این سوال که چرا بعضی از ویروسها ، تنها در میزبانهای خاصی قادر به رشد هستند.

روشهای عمل Enhancer

به نظر می‌رسد که Enhancerها در 4 روش متفاوت عمل می‌کنند.

  1. ممکن است، یک فعال کننده به یک Enhancer متصل و تحریک نسخه برداری را سبب شود، یا اینکه به جذب RNA پلی مراز به پروموتر ، کمک نماید. Enhancerهایی که به عنوان عناصر حساس به هورمون شناخته شده‌اند، به این روش عمل می‌نمایند.

  2. حضور Enhancerها ممکن است ساختمان DNA را در مجاورت ژنی که نسخه برداری می‌شود، تحت تاثیر قرار دهد. بنابراین این ناحیه از DNA را بیشتر در دسترس RNA پلی مراز قرار می‌دهند. مشاهده نسبتهای متفاوتی از پیریمیدین/ پورین در بسیاری از این Enhancerها که پذیرش ترکیب ساختمانی غیر طبیعی را در Invivo سبب می‌شود، این تئوری را حمایت می‌کند.

  3. Enhancerها ممکن است در جایی از DNA که به ماتریکس هسته ، متصل می‌باشد، قرار داشته باشند. بنابراین نگهداری DNA در این قسمت و افزایش غلظت موثر RNA پلی مراز را سبب می‌شوند.

  4. Enhancerها ممکن است، یک جایگاه بزرگ هدف ایجاد نمایند که RNA پلی مراز یا تعداد دیگری از پروتئینهای ضروری ، قبل از مهاجرت به پزوموتر ، در آن ناحیه با DNA باند می‌شوند. بر اساس این نوع مکانیسم ، مشاهده شده است. زمانی که یک جایگاه به پروتئین متصل شوند، در بین بعضی از Enhancerها و پروموترها قرار می‌گیرند، از عمل Enhancer جلوگیری به عمل می‌آید. به نظر می‌رسد که پروتئین باند شده ، مهاجرت پروتئین دیگر را Enhancer به پروموتر بلوکه می‌کند.

آزمایشات نشان می‌دهد که بعضی از Enhancerها تنها در یک بافت خاص هستند. به عنوان مثال در موش Enhancerهای ژنهای ایمونوگلولین ، تنها در سلولهای لمفوئید موثر می‌باشند. اینگونه مشاهدات ، موید این موضوع است که Enhancerهای خاص ، ممکن است بوسیله یک پروتئین تنظیم کننده باند شده به DNA که تنها در گلبولهای سفید خون یافت می‌شوند، تشخیص داده شوند.


نوع مطلب : بیولوژی سلولی،
برچسب ها :

جمعه دوم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM

آنزیمهای پلیمراز

آنزیمهایی هستند که پلیمر شدن زنجیره‌های پلی‌نوکلئوتیدی را کاتالیز می‌کنند. تا کنون سه نوع آنزیم پلیمراز به نامهای Ι و ΙΙ و ΙΙΙ جداسازی و مشخصات آنها ارائه شده‌اند. از بین آنها آنزیم پلیمراز ΙΙΙ نقش اصلی را در سنتز DNA دارد. از خصوصیات مهم آن ، این است که منحصرا نوکلئوتیدها را در جهت ‘۵ به ‘۳ بهم متصل می‌کنند و در جهت عکس نمی‌تواند عمل کند. آنزیم پلیمراز ΙΙ نیز در مرحله‌ای از سنتز DNA وارد شده و سنتز را در جهت ‘۳ به ‘۵ پیش می‌برد. و آنزیم پلیمراز I عمل ترمیم همانند سازی را انجام می‌دهد.

آنزیم هلیکاز

این آنزیم به مولکول DNA دو رشته‌ای متصل شده و با عمل خود موجب باز شدن دو رشته از یکدیگر می‌شود.

آنزیم لیگاز

در مرحله‌ای از سنتز DNA وارد عمل شده و دو رشته DNA را بهم پیوند می‌دهد.

آنزیم پریماز

آنزیمی است که در ساختن قطعه کوچک RNA پرایمر ، هنگام همانند سازی وارد عمل شده و نوکلئوتیدهایی از نوع اسید ریبونوکلئوتید را به یکدیگر متصل می‌کند. تعدادی پروتئینهای ویژه وجود دارند که پس از باز شدن دو رشته DNA از یکدیگر به محلهای باز شده متصل شده و مانع اتصال مجدد دو رشته به یکدیگر می‌شوند.

آنزیم های خاصی باعث ایجاد ((شکافهایی))در یکی از مارپیچ مضاعف باز شده می شود و به این ترتیب امکان ادامه یافتن روند باز شدن مارپیچ فراهم می گردد. آنزیم های باز کننده شکافها DNA  توپوایزومراز نامیده می شود.

کمپلکس DNA پلیمراز

تعدادی از مولکول های مختلف dna پلیمراز در همانند سازی شرکت دارند.این مولکول ها سه خاصیت مشترک دارند

-طویل شدن زنجیره

-پیشرفت

-تصحیح

پلیمراز ۲ بیشتر با تصحیح و ترمیم ارتباط دارد . پلیمراز ۱ سنتز زنجیره را بین قطعات اکازاکی واقع بر رشته دنباله رو دنبال می کند

مناطق غیر طبیعی DNA چه بر اثر خطا در نسخه برداری و چه بر آسیب DNA طی سه مکانیسم جایگزین می شوند

- ترمیم بد

- ترمیم با خارج کردن باز

- ترمیم با خارج کردن نوکلئوتید



نوع مطلب : بیولوژی سلولی،
برچسب ها :

جمعه دوم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM

سلول­های پروکاریوت فقط یک نوع RNA پلیمراز دارند. (RNA پلیمراز پروکاریوتی، پروتئینی است؛ که تمام مراحل فرایند رونویسی را انجام می­دهد.)

سلولهای یوکاریوتی دارای سه نوع RNA پلیمراز هستند:

RNA پلیمراز I: رونویسی از ژن­های rRNA

RNA پلیمراز II: رونویسی از پیش ساز­های mRNA و برخی RNA های کوچک

RNA پلیمراز III: رونویسی از ژن­های tRNA و نیز بعضی دیگر از RNA های کوچک

مراحل فرایند رونویسی

بر اثر فرآیند رونویسی mRNA ساخته می­شود مهم است بدانید که: تمام DNA رونویسی نمی­­گردد و فقط بعضی از قسمتهای DNA رونویسی می­گردد( قطعاتی از DNA که به صورت mRNA رونویسی می­گردند ژن نام دارند.) فرآیند رونویسی در سلول­های یوکاریوت کمی پیچیده­تر از سلول­های پروکاریوتی است. تنها یکی از دو زنجیره DNA رونویسی می­گردد( ولی همیشه همان زنجیره DNA رونویسی نمی­گردد. به طوری که برای بعضی از ژن­ها یک زنجیره و برای ژن­های دیگر زنجیره دیگر، رونویسی می­گردد.

پروموتر:

قسمتی از ژن یا مولکول DNA (بخشی تنظیمی ژن) است که امکان آغاز صحیح رونویسی را به RNA پلی مراز می دهد.

محل راه انداز: درست در قبل از محلی قرار گرفته که رونویسی از آنجا آغاز می گردد. (در نزدیکی آغاز رونویسی)

جایگاه آغاز رونویسی: اولین نوکلئوتیدی که از DNA رونویسی میگردد. (طبق قرارداد آن را با ۱+ نشان میدهند.)

نکته:

هنگامیکه RNA پلی مراز با ناحیه راه انداز بر هم کنش اختصاصی و محکمی برقرار می کند، DNA دو رشته ای را در این محل از هم باز می کند، که اصطلاحا این ساختمان را حباب رونویسی میگویند.

مرحله طویل شدن زنجیره­ی RNA :

  • آنزیم RNA­پلی مراز روی مولکول DNA (روی یکی از رشته های DNA ) حرکت می کند.
  • آنزیم RNA پلی مراز در مقابل هر یک از دئوکسی ریبونوکلئوتیدهای  DNA ، ریبونوکلئوتیدهای RNA مکمل را قرار می دهد.
  • آنزیم RNA پلی مراز هر ریبونوکلئوتید جدید را به ریبونوکلئوتید قبلی متصل می کند. (پیوند فسفودی­استر)

نکته:

در فرایند رونویسی قواعد جفت شدن رعایت میشود و فقط یک تفاوت وجود دارد:

در مقابل دئوکسی ریبونوکلئوتید آدنین دار (A) در DNA ریبونوکلئوتید اوراسیل­دار (U) در  RNA قرار میگیرد.

مرحله پایان رونویسی:

  • آنزیم RNA پلی مراز از جایگاه پایان رونویسی عبور کرده و از آنجا رونویسی می کند.
  • جدا شدن RNA پلی مراز، DNA و mRNA تازه ساخته شده از یکدیگر.
  • آزاد شدن mRNA برای مرحله ترجمه.

مقایسه فرآیندهای رونویسی و همانندسازی:

شباهت:

در هر دو مکانیسم از دئوکسی ریبونوکلئوتیدهای DNA به عنوان الگو برای ساخت مولکول جدید استفاده می شود.

تفاوتها:

۱-   در همانندسازی DNA ساخته میشود ولی در رونویسی RNA ساخته می شود.

۲-   در همانندسازی هر دو رشته DNA به عنوان الگو مورد استفاده قرار می گیرد ولی در رونویسی فقط یکی از رشته های DNA الگو قرار می گیرد.

۳-   در رونویسی همزمان تعداد زیادی RNA از روی DNA ساخته میشود.



نوع مطلب : بیولوژی سلولی،
برچسب ها :

جمعه دوم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM

دانشمندان چيني با استفاده از نانوذرات شاخه‌دار نقره روشي جديد و سازگار با محيط زيست (سبز) براي جداسازي DNA يافته‌اند.

 

 

مي‌توان از نانوذرات براي شناسايي DNA استفاده کرده و سپس با استفاده از نيروي گرانش زمين به راحتي آنها را از مخلوط جدا کرد.


روش‌هاي جداسازي در زمينه‌هاي مختلفي از تشخيص بيماري‌ها گرفته تا بررسي‌هاي زيست‌محيطي به‌کار مي‌روند. تاکنون از مواد زيادي براي جداسازي مخلوط‌هاي شيميايي پيچيده استفاده شده است، اما اخيرا توجه زيادي به سوي نانوذرات مغناطيسي معطوف شده است، زيرا مي‌توان اين نانوذرات را به آساني بازيافت کرد. با اين حال تهيه نانوذرات مغناطيسي به واکنشگرهاي آلي و انرژي زيادي نياز داشته و رسيدن به ابعاد مورد نظر مي‌تواند دشوار باشد.

حال اِرکانگ وانگ و همکارانش از موسسه شيمي کاربردي چانگهون نوعي ذره بلوري نقره به‌نام دندريت ساخته‌اند که مي تواند جايگزين نانوذرات مغناطيسي معمول در جداسازي DNA شود. وانگ مي‌گويد: «ابداع يک روش آسان، اقتصادي و ساده براي سنتز ذرات جديد يکنواخت با اندازه کنترل‌شده و داراي قابليت تغيير آسان که بتواند جايگزين نانوذرات مغناطيسي شود، دشوار است».

وانگ از ميکرودندريت‌هاي نقره بري آناليز ويروس انساني T-lymphotropic نوع I (HTLV-I) که به بيماري سرطان خون و غده لنفاوي مربوط است، استفاده کرد. روي اين ميکرودندريت‌هاي نقره ابتدا روبشگري متصل شد که بتوانند DNA را هدف بگيرند. سپس اين ذرات با يک روبشگر فلورسانس تجهيز شدند تا امکان تشخيص هدف با استفاده از ميکروسکوپ روبشگر ليزري هم‌کانون فراهم شود. در اين فرايند جداسازي از نيروي گرانش زمين استفاده مي‌شود که در نتيجه نياز به ميدان مغناطيسي نداشته و فرايند جداسازي ساده‌تر مي شود.

ولفگانگ فريتش متخصص نانويبوفتونيک از موسسه فناوري‌هاي فتونيکي در آلمان مي‌گويد: «اگر اين راهکار بتواند ابزار نانوذره‌اي ديگري به مجموعه ابزارهاي موجود براي جداسازي بيافزايد، به‌نحوي که نيازي به ذرات مغناطيسي يا سانتريفوژ نداشته باشد، بسيار خوب است».

وانگ مي‌گويد: «با استفاده از اين روش مي توانمواد شيميايي ديگري همچون پروتئين‌ها، آلاينده‌هاي آلي و حتي فلزات سنگين را شناسايي کرد». او مي‌افزايد گام بعدي ما توسعه اين روش براي آناليز نمونه‌هاي واقعي است.


نوع مطلب : اخبار علمی، بیوشیمی،
برچسب ها :

پنجشنبه یکم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM


1. همسانه سازی ژن ( Gen cloning ) مورد نظر :

همسانه سازی می تواند نمونه خالصی از یک ژن منفرد بطور مجزا از کلیه ژنهای دیگر موجود در سلول فراهم کند . امروزه روشهای مختلفی برای همسانه سازی DNA مورد استفاده قرار می گیرد.

 

2. ایجاد همزمانی (Synchronization ) بین حیوان دهنده و حیوان گیرنده :

در تمامی تکنیکهای مختلفی که در آن ها ، تکنیک انتقال جنین مورد استفاده قرار می گیرد. (تولید حیوانات انتقال ژنی نیز یکی از این تکنیکها است.) از آنجا که جنین های حاصل از این تکنیکها در رحم حیواناتي غیر از حیوانات دهنده ( تخمک یا جنین ) قرار می گیرد ، باید بین حیوانات دهنده و حیوانات گیرنده جنین در سیکل تولید مثلی ، همزمانی ایجاد کرد. در این روش از طریق تزریق گنادو تروپینها با برنامه خاصی که در گونه های مختلف متفاوت است، بین حیوان دهنده و حیوانات گیرنده همزمانی ایجاد می شود . در برخی از گونه ها مانند جوندگان ، حیوانات گیرنده حتماً باید در آبستنی کاذب ( Pseudo pregnancy ) باشند . برای القاء آبستنی کاذب ، شرایط جفت گیری ماده ها با نرهای وابران برداری شده فراهم می شود . زیرا که تحریک شدن گردن رحم ( Cervix ) در جوندگان برای تداوم آبستنی ضروري است .


بقیه در ادامه مطلب


ادامه مطلب

نوع مطلب : ژنتیک مولکولی،
برچسب ها :

پنجشنبه یکم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM
امروزه از مارکرهای مولکولی و به ویژه مارکرهای مبتنی بر DNA به طور گسترده ای در بسیاری زمینه ها از قبیل نقشه یابی و ردیابی ژن ها، تعیین جنسیت، بررسی تنوع ژنتیکی یا روابط ژنتیکی به کار می روند. در ژنتیک جمعیت مارکهای مبتنی بر پروتئین (آلوزایم ها) اولین مارکرهایی بودند که به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفتند. روشهای مبتنی بر DNA امروزه بهترین روش هایی هستند که برای تمایز بین موجودات بسیار نزدیک به هم انتخاب می شوند. استفاده از مارکر های مبتنی بر DNA حتی امکان مقایسه های کارآمدی را نیز فراهم می نماید.
1- 1 تعریف ها

بر اساس تعریفی که استنزفلد در 1986 ارایه داد، واژه مارکر معمولاً برای مارکر لوکاس به کار می رود. هر ژنی جایی در طول کروموزوم به نام لوکاس دارد. ژن ها می توانند از طریق جهش به چندین شکل متفاوت تبدیل شوند که آلل (یا شکل های آللی) نامیده می شوند. تمامی شکل های آللی یک ژن در یک جایگاه در کروموزوم های هومولوگ قرار می گیرند. هنگامی که شکلهای آللی یک لوکاس یکسان باشند، گفته می شود که ژنوتیپ، هوموزایگوت (در این لوکاس) است، در حالی که شکلهای آللی متفاوت، هتروزایگوت را ایجاد می نمایند. در موجودات دیپلویید، ژنوتایپ با دو شکل آللی کروموزوم های هومولوگ ایجاد می گردد. بنابراین مارکرهای مولکولی عبارتند از تمامی مارکرهای لوکاس های مربوط به DNA (مارکرها میتوانند بیوشیمایی یا مورفولوژیک نیز باشند).

1-2 مارکر مولکولی مناسب برای ژنتیک جمعیت کدام است؟

یک مارکر مولکولی مناسب باید:

1-1. توارث مندلی داشته باشد: یعنی از نسلی به نسل دیگر منتقل شود.

1-2. پلی مورفیک باشد: یعنی آلل های متعددی را در لوکاس مورد بررسی نشان دهد.

1-3. هم بارز باشد: یعنی بتوان هوموزایگوت و هتروزایگوت را از هم تشخیص داد.

1-4. خنثی باشد: یعنی همه آلل ها شایستگی یکسانی داشته باشند.

1-5. اپیستازی نداشته باشد: یعنی بتوان بدون توجه به سایر لوکاسها ژنوتیپ هر فنوتیپی را تعیین نمود.

1-6. مستقل از محیط باشد: یعنی فنوتایپ از محیط تأثیری نپذیرد.

1-7. در طول ژنوم زیاد تکرار شود.

1-8. تکرارپذیری بالایی داشته باشد.

مارکرهای پرکاربرد در ژنتیک جمعیت عبارتند از: آلوزایم ها، RAPD، RFLP، AFLP، انگشت نگاری مینی ستلایت ها، مایکروستلایت ها و SSR.

انتخاب یک مارکر مولکولی به مناسب بودن آن برای پاسخ دادن به یک پرسش اکولوژیک بستگی دارد. بنابراین آنها برای تخمین جریان ژنها بین جمعیت ها مثلاً به منظور بررسی تنوع مناسبترند یا ترجیح داده می شوند. از طرف دیگر مارکرهای غالب می توانند ژنوتیپ را تخمین بزنند اما نمی توانند فراوانی های آللی را تخمین بزنند. مارکرهای غالب ترجیحاً برای انگشت نگاری به کار رفته و می توانند در شناسایی کلون ها مفید باشند.

برای بررسی تنوع ژنتیکی Cirsium arense از مارکر جدیدی به نام AFLP استفاده شد. این مارکر تمامی ویژگی های یک مارکر های مولکولی مناسب را غیر از همبارز بودن دارد. مارکرهای AFLP مارکرهای غالب هستند. با این حال به علت پلی مورفیسم بالایی که مارکرهای AFLP تشخیص می دهند کارآمدترین مارکر هستند. به خصوص در جایی که روابط نزدیکی وجود دارد. به علاوه از نگاه تکنیکی هیچ اطلاعاتی از توالی DNA نیاز نیست، مارکرهای زیادی را می توان در مدت کوتاهی بررسی نموده و تنها مقدار کمی DNA لازم است.

2. AFLP

پلی مورفیسم طول قطعات تکثیر شده تکنیک جدیدی در انگشت نگاری DNA است که توسط زابیو و ووس (1993) ابداع شد البته به ووس و همکاران (1995) و ووس و کویپر (1997) نیز مراجعه کنید. این روش مبتنی بر تکثیر قطعات برش یافته انتخابی حاصل از هضم کلی DNA ژنومی با PCR است. محصولات تکثیر که قبلاً نشاندار شده اند از طریق الکتروفورز از هم تفکیک می شوند. طول قطعات DNA حاصل بین 60 تا 500 جفت باز است. برای قابل مشاهده نمودن پلی مورفیسم DNA که معمولاً از قطعات کوچک چند جفت بازی DNA (حداکثر تا 500) تشکیل شده ابتدا این قطعات باید تکثیر یابند. این تکثیر اغلب از طریق PCR انجام می گیرد. روش PCR می تواند قطعات خاصی از DNA را طی آغاز دقیق واکنش پلی مریزاسیون که در دو انتهای DNA مورد نظر اتفاق می افتد تکثیر یابد. این آغاز دقیق توسط توالی های الیگونوکلئوتیدی کوتاهی (پرایمرها) انجام می شود که می تواند DNA الگو را در ناحیه مورد نظر ذوب نماید. پرایمرها بین 18 تا 24 جفت باز طول داشته و در آزمایشگاه و مطابق توالی DNA مکمل خود که در ناحیه باز شده رشته سنگین DNA مورد نظر سنتز می شود. PCR ابتدا با یک فاز حرارتی بالا (واسرشت سازی) آغاز می شود که طی آن DNA تک رشته ای تولید می شود. آنزیم تک پلی مراز هر یک از رشته های DNA دو رشته ای را به صورت نقطه آغازی برای سنتز شناسایی کرده و با رسیدن دما به 72 درجه سانتیگراد واکنش پلمریزاسیون را در جهت 5' 3' ادامه می دهد (دمای بهینه طویل شدن). بنابر این برای طراحی پرایمرهای اختصاصی باید توالی های نواحی بازشدگی DNA مورد نظر را بدانیم. در نتیجه اطلاعات ما درباره ژنوم بیشتر شده و مطالعات بسیار دقیق تری می توان انجام داد. این مرحله نیاز به تجهیزات کامل آزمایشگاهی داشته و اغلب بسیار وقت گیر است. اساس روش AFLP طراحی و سنتز پرایمرهای اختیاری و سپس اتصال آنها به قطعاتDNA هدف است. پرایمرهای اختیاری AFLP آداپتور نامیده شده و از توالیهای 20 نوکلئوتیدی شناخته شده ای تشکیل شده اند. توالی های DNA هدف، قطعات DNA حاصل از آنزیم های برشی هستند. این قطعات از هضم کلی DNA ژنومی از اثر ترکیبی دو آنزیم برشی ایجاد می گردند. سپس آداپتورها با کمک آنزیم لیگاز به دو سر قطعات برش یافته متصل می شوند. سرانجام طی یک مرحله PCR آداپتورها به عنوان جایگاه های آغاز تکثیر قطعات برش یافته به کار می روند. مارکرهای AFLPپلی مورفیسم جایگاه برش را آشکار نموده و باید به عنوان مارکرهای غالب در نظر گرفته شوند. زیرا نمی توان هوموزایگوت ها و هتروزایگوت ها را از هم تشخیص داد، مگر این که مطالعات اصلاح نژادی و شجره ای انجام شود تا الگوهای توارث هر قطعه مشخص شود. اما بسیاری از قطعات تخمین هایی از تنوع را در سراسر ژنوم نشان می دهند. بنابراین نمایی کلی از سطح تنوع ژنتیکی موجود مورد مطالعه را نشان نشان می دهند.

2-2- مراحل اصلی انگشت نگاری با AFLP

2-2-1- استخراج DNA

DNA خالص و با وزن مولکولی بالا برای AFLP ضروری است. در اینجا DNA با روش دایل و دایل استخراج شده است(Doyle and Doyle, 1988). این روش بر اساس فرآیند CTAB انجام می شود. برای جزئیات بیشتر به بخش های پروتوکل (3-3) و عیب یابی (4-3) مراجعه نمایید.

2-2-2- هضم با آنزیم های برشی

قطعات برش یافته DNA ژنومی با استفاده از دو آنزیم برشی مختلف به دست آمده اند: یک آنزیم برشی فراوان (آنزیم برشی چهار بازی MseI) و یک آنزیم برشی نادر (آنزیم برشی شش بازی EcoRI). آنزیم رایج تر برای ایجاد قطعات کوچک که به خوبی تکثیر شده و برای تفکیک روی ژل الکتروفورز مناسب ترند در حالی که آنزیم نادرتر تعداد قطعاتی را که را باید تکثیر شوند محدود می نماید.

2-2-3- اتصال آداپتورهای الیگونوکلئوتیدی

آداپتورهای دو رشته ای از یک توالی مرکز و یک توالی اختصاصی برای هر آنزیم تشکیل شده اند. بنابراین آداپتورها برای جایگاه برش هر یک از آنزیم های EcoRI و MseI اختصاصی عمل می کنند. معمولاً مراحل برش آنزیمی و اتصال به آداپتورها در یک مرحله صورت می گیرد. اتصال آداپتور به DNA برش یافته جایگاه برش را دچار تغییر می کند تا از برش ثانویه پس از اتصال آداپتورها جلوگیری نماید. توالی مرکزی آداپتورها از یک توالی شناخته شده 20 نوکلئوتیدی تشکیل شده که بعداً در PCR به عنوان پرایمر به کار می رود.

2-2-4- تکثیر اولیه

این مرحله یک PCRمعمولی است که در آن از آداپتورها به عنوان پرایمر استفاده شده است. این PCR اولیه تکثیر اولیه نیز نامیده می شود که امکان انتخاب اولیه قطعات را از طریق تکثیر قطعات برش یافته DNA که به دو انتهای آن آداپتور متصل است فراهم می نماید. علاوه بر توالی های آداپتورها، پرایمرهای به کار رفته برای تکثیر اولیه یک باز اضافی هم دارند. این باز اضافی امکان یک گزینش مضاعف را از طریق تکثیر یک چهارم از قطعاتی که یک آداپتور به هر یک از دو سر آن متصل است مقدور می نماید. این سه مرحله (استخراج DNA، هضم آنزیمی / اتصال آداپتورها و تکثیر اولیه) را می توان روی یک ژل آگاروز 6/1% الکتروفورز و قابل مشاهده نمود.

2-2-5- تکثیر انتخابی

هدف از انجام این مرحله محدود کردن سطح پلی مورفیسم و نشاندار کردن DNA است. برای انجام این تکثیر، سه نوکلئوتید به انتهای َ3 توالی پرایمر به کار رفته در تکثیر اولیه (= توالی آداپتور + 3 نوکلئوتید). این دو نوکلئوتید اضافی تکثیر را گزینشی تر نموده و تعداد قطعات برش یافته ای که تکثیر می شوند (پلی مورفیسم) را کاهش می دهد. به علاوه یکی از پرایمرها (معمولاً پرایمر EcoRI) با یک ماده فلورسانت نشاندار شده و می توان حرکت DNA را در الکتروفورز ردیابی نمود.



نوع مطلب : ژنتیک مولکولی،
برچسب ها :

پنجشنبه یکم اردیبهشت 1390 :: نويسنده : NTM

مقدمه بیوتکنولوژی که به صورت توانایی بکارگیری فرآیندهای زیستی در بعد صنعتی تعریف می‌شود در دو دهه گذشته ، کاربردهای گستردهای در عرصه‌های کشاورزی و بهداشت ، محیط زیست یافته است. بیوتکنولوژی در مفهوم عام و نزد اکثریت مردم معنای درآمد بی‌دردسر را تداعی نموده است و در دهه اخیر این کلمه را غالبا به مفهوم همه چیز برای همه مردم بکار می‌برند.
تاریخچه بیوتکنولوژی نشان می‌هد که سابقه استفاده از آن به 8 هزار سال قبل می‌رسد. از دهه 1980 ، بیوتکنولوژی زمینه جدیدی را برای رشد پیدا نمود که ‌این تغییر مرهون پیشرفتی است که حاصل فن‌آوری برش و اتصال مولکولdna به صورت دلخواه می‌باشد. اکنون این تفکر که بیوتکنولوژی با تکیه بر دستاوردهای مهندسی ژنتیک قادر است منافع عظیمی را نصیب بشریت نمایند، به شدت تقویت یافته است.


بقیه در ادامه مطلب



ادامه مطلب

نوع مطلب : بیوتکنولوژِی،
برچسب ها :





Powered by WebGozar

onLoad and onUnload Example